Офіційний сайт КЛПЗ "Чернігівська міська лікарня № 3" ЧМР
 

Аналіз рівня захворювань, що передаються статевим шляхом

в м. Чернігові та Чернігівській області за 2009-2011рр.

Завідувач лабораторії полімеразної

ланцюгової реакції ЧМЛ№3,

 лікар-вірусолог ІІ категорії Гончар М.В.

Для того щоб вилікувати хворого, потрібно знати, чим конкретно він хворий. При постановці діагнозу лікар використовує дані лабораторних досліджень, без яких встановити вірний діагноз важко, чи в ряді випадків зовсім неможливо.

З ціллю досконалості лабораторної діагности інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ) в 2007році міською лікарнею було отримано обладнання PCR  RealTime і організована лабораторія молекулярно-генетичних досліджень, що дозволило проводити діагностику збудників інфекційних захворювань методом ПЛР в реальному часі. В нашій лабораторії з використанням технології  PCR  RealTime проводиться якісний, можливий і кількісний аналіз збудників, одночасне визначення декількох збудників в клінічному матеріалі в одній реакції ампліфікації за допомогою тест-систем в форматі „мультипрайм”, генотипування вірусів.

       При великих об’ємах досліджень використання мультиплексних тест-систем дає ряд переваг: зменшення кількості постановок ПЛР, збільшення пропускної властивості ампліфікатора, збільшується загальна пропускна властивість лабораторії без додаткового обладнання, економія часу на етапі підготовки до постановки ПЛР (при розкапуванні Зразків ДНК), зменшення собівартості дослідження.

        Нами накопичений конкретний досвід по діагностиці ІПСШ і проаналізована структура виявленності генетичного матеріалу збудників у пацієнтів, проходивши діагностику методом ПЛР в Чернігівській міській лікарні №3 (див. табл.).

        Потрібно сказати про проблеми ПЛР—це, по-перше можливість контамінації лабораторії продуктами ампліфікації. При проведенні ПЛР з використанням електрофоретичної детекції, яка припускає відкриванні пробірок з продуктами ампліфікації, риск контамінації лабораторії дуже високий, і як наслідок—поява хибно-позитивних результатів. Знизити ризик  контамінації допомогає використання УДГ (урацил-ДНК-глікозилаза). Ймовірність контамінації вдається попередити, також, при використанні обладнання для ПЛР в реальному часі.

       Хотілося б приділити увагу на декілька найбільш важливих аспектах, які визначають отримання якісних результатів аналізу,на які необхідно звернути увагу при використанні методів ампліфікації нуклеїнових кислот для діагностики ІПСШ.

-         Дотримання правил забору і збереження клінічного матеріалу.

-         Якісна обробка клінічного матеріалу і екстракція нуклеїнових кислот.

-         Проведення дослідів з використанням контролей.

-         Використання якісних наборів реагентів.

-         Проведення зовнішнього і внутрішнього контролю якості.

-         На пре-аналітичному етапі важливим, при проведенні ПЛР-досліджень, є дотримання правил забору і збереження клінічного матеріалу.

Забір клінічного матеріалу необхідно проводити із ймовірного місця знаходження мікроорганізмів і розвитку інфекції( для цього необхідно враховувати вхідні ворота, шляхи розповсюдження, місця розмноження і шляхи виділення шуканих мікроорганізмів). Присутність в відібраному матеріалі великої кількості слизу, гною, крові негативно впливає на якість виділення ДНК і  сприяє деградації ДНК при збереженні і транспортуванні. Для отриманні клінічного матеріалу необхідно використовувати підходящий інструментарій. Використання для цієї мети одноразового універсального зонду з синтетичним ворсом, є на мій погляд, оптимальним.

    Не менш важливим етапом молекулярно-біологічного дослідження є етап оброблення клінічного матеріалу і екстракції нуклеїнових кислот. За час використання в лабораторній діагностиці метода ПЛР ми набули визначений досвід. Для виділення ДНК із клінічного матеріалу використовувались набори „ДНК-Експрес” (ВОТ „Літех”, ЗАТ „ДНК-Технологія”), і комплект реагентів „ДНК-сорб-АМ” ФГУН ЦНИИЄ Роспотребнадзора (Росія). Для порівняльного аналізу була обстежена група із 100 пацієнтів у віці від 19 до 45 років  ( 67 зразків із цервікального каналу у жінок і 33—із уретри у чоловіків). Ми дали оцінку ефективності екстракції ДНК із клінічного матеріалу цими комплектами реагентів: знайдено „ДНК-Експресс”—9 (75%), знайдено „ДНК-сорб-АМ”—12, не виявлено „ДНК-Експресс”—3(25%).

Втрати ДНК у процесі екстракції „ДНК-Експресс” склали 25%. При використанні експресс-виділення здійснюється мінімум маніпуляцій, економиться час і витратні матеріали, але ефективність екстракції нижча, ніж при використання сорбент них методик, а ймовірність контамінації від проби до проби не нижча, в деяких випадках навіть вища. Крім цього, використовується весь матеріал і відсутня можливість повторного тестування  вихідних зразків. Тому ми категорично против використання експресс методів для МАНК.

Отримані нами дані збігаються з даними з оцінки ефективності використання сорбційного експрес методів наших колег із НМАПО ім.. П.Л. Шуліка, а також російських і білоруських спеціалістів.

-                     Для того щоб максимально контролювати роботу ПЛР-лабораторії і знизити долю хибних результатів, необхідна постановка контрольних зразків ( ОК—на етапі екстракції, К-, К+ - на етапі ампліфікації) і внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ).Внутрішній контрольний зразок (ВКЗ) повинен використовуватися на всіх етапах ПЛР. Маючі дані про те, як пройшла реакція в присутності контролей, можливо давати оцінку ефективності виділення ДНК в кожній конкретній пробірці, реакції ампліфікації і детекції. При використанні тест-систем без контроля етапа екстракції можливе отримання хибно-негативних результатів. В нашій лабораторії при повторному тестуванні зразків, не валідних по ВКЗ в 9% випадків була виявлена інфекція. Дуже наочним прикладом є робота ВКО в тест-системах, які визначають ВПЛ і ЦМВ-інфекції, де використовується ендогенний внутрішній контроль (ділянка β-глобінового гену людини), який дозволяє контролювати не тільки всі етапи ПЛР-аналізу, але і адекватність забору матеріалу і його збереження.

-                     Для успішного використання ПЛР-аналізу в лабораторній діагностиці, крім правильного планування приміщення і організації роботи в лабораторії, присутність висококваліфікованого персоналу, дуже важливим є використання стандартизованих і апробованих тест-систем, які відповідають усім вимогам, що пред’являються до ПЛР діагностики . Існують  загальноприйняті  в світовій спільноті критерії якості діагностичних тестів. Ми у свої роботі використовуємо набори реагентів „АмпліСенс” ФГУН ЦНИИЭ Розпотрібнагляду , які мають міжнародні сертифікати якості, що забезпечують високу специфічність і  відтворюванність результатів. В тест-системах використовується  стандартизований метод виділення нуклеїнових кислот з використанням сорбента, за допомогою контрольних зразків контролюються всі етапи ПЛР-аналізу, починаючи з стадії виділення нуклеїнових кислот.

-                    Безумовно, необхідно виконувати внутрішній і зовнішній контроль якості досліджень. В своїй лабораторії, крім аналізу результатів ПЛР з урахуванням всіх контрольних зразків, ми один раз на  квартал тестуємо зашифровані зразки ( позитивні і негативні зразки матеріалу), аналізуємо контрольні змиви на наявність продуктів ампліфікації. Дані змивів заносяться у журнал по контролю деконтамінаційних заходів та виявлення можливої контамінації ПЛР лабораторії нуклеїновими кислотами, продуктами ампліфікації. Розроблена документія—Порядок проведення моніторингу та наявність продуктів ампліфікації.

-                    У висновку треба відмітити, що на сьогоднішній день актуальним становиться розробка референт-центром контрольних панелей для ПЛР досліджень і участь нашої ПЛР лабораторії в програмі міжлабораторних порівнянь результатів вимірювань  (МПР).

Всього проведено за:

-                     2009рік—4808 аналізів;

-                     2010рік—4955 аналізів;

-                     2011рік—4247 аналізів.

Таблиця. Виявляємість генетичного матеріалу збудників ІПСШ методом ПЛР 2009—2011рр.

 

2009

2010

2011

Chlamydia trachomatis

проведено досліджень

660

561

572

в тому числі

позитивні

41

33

19

відсоток позитивних (%)

6,2

5,88

4,26

Mycoplasma hominis

проведено досліджень

353

435

512

в тому числі

позитивні

54

52

32

відсоток позитивних (%)

17

11,95

8,8

Mycoplasma genital

проведено досліджень

355

416

510

в тому числі

позитивні

21

16

14

відсоток позитивних (%)

5,9

3,85

3,5

Ureaplasma urealyticum/

parvum

проведено досліджень

 852

950

1220

в тому числі

позитивні

192

202

180

відсоток позитивних (%)

45

42,5

29,5

Gardnerella vaginalis

проведено досліджень

234

306

439

в тому числі

позитивні

95

120

138

відсоток позитивних (%)

40,5

39,2

31,4

Candida albicans

проведено досліджень

84

162

239

в тому числі

позитивні

12

18

21

відсоток позитивних (%)

14,2

11,11

11

Neisseria gonorrhoeae

проведено досліджень

91

187

209

в тому числі

позитивні

-

1

2

відсоток позитивних (%)

-

-

1,3

Trichomonas vaginalis

проведено досліджень

94

199

265

в тому числі

позитивні

4

2

2

відсоток позитивних (%)

4,2

1

0,75

HSV ½

проведено досліджень

498

359

334

в тому числі

позитивні

29

14

11

відсоток позитивних (%)

5,8

3,9

4,8

CMV

проведено досліджень

507

406

350

в тому числі

позитивні

56

28

16

відсоток позитивних (%)

11

6,9

5,88

HPV 16,18

проведено досліджень

1080

950

774

в тому числі

позитивні

62

48

47

відсоток позитивних (%)

11,48

10,78

12,14

HCV

проведено досліджень

-

42

26

в тому числі

позитивні

-

-

-

відсоток позитивних (%)

-

-

-

HBV

проведено досліджень

-

42

26

в тому числі

позитивні

-

-

-

відсоток позитивних (%)

-

-

-


Розподіл збудників по густоті виявлення на протязі всього періоду спостереження, як правило, залишалось незмінним: перше місце займали U.urealyticum/parvum, друге – G.vaginalis, третє – HPV 16,18  ,далі відповідно M. hominis, C. albicans , CMV, C. trachomatis  і т.д.

Потрібно відзначити, що в 2009 році C. trachomatis-6,2%, U.urealyticum/parvum—45%, M. hominis—17%, найбільш високі показники виявляємості, а вже в 2010 і в 2011рр відповідно (C. trachomatis—5,88% і 4,26%, U.urealyticum/parvum—42,29% і 29,5%, M. hominis—11,95% і 8,8), M.genitalium також частіше виялялась в 2009році—5,9%, а в2010 і 2011 відповідно—3,85% і 3,5%.

Для ВПЛ характерне 2009р—11,4%, 2010р—10,78% і в 2011р—12,14% збільшення виявляє мості.

Таким чином, дані тенденції циркуляції збудників:

-         широке розповсюдження U.urealyticum/parvum, G.vaginalis,M. hominis, HPV—16/18;

-         відсутність  дуже великих коливань показників частоти виявлення C. trachomatis, M.genitalium, HPV—16/18;

-         збереження розподілу інфекційних агентів за частотою виявлення на протязі періоду спостереження 2009-2011рр.

 

Для порівняння приводжу такі дані: Матеріали VII всеросійської научно-практичної конференції з міжнародною участю „ Молекулярна діагностика 2010”.

Мазепа В.Н. , Бруснигіна Н.Ф., Черневська О.М, Орлова К.А., Сперанська Е.В., Скобло Л.Е., Махова М.А., Кленіна Н.Н., Баришеві Н.Н.

Таблиця частоти виявлення збудників НУГІ ( не гонококові урогенітальні інфекції)за роками.

Рік

Частота виявлення збудників НУГІ (в %)

U.urealyticum/parvum

C. trachomatis

M. hominis

M.genitalium

n

%

n

%

n

%

n

%

2009

1846

49,6

3342

7,61

1472

17,8

2569

4,2

2010

2072

43,4

3578

6,3

1685

14,5

3480

3,5

2011

1932

43,1

3387

6,1

1543

17,9

3342

3,1

Для більшого моніторингу ІПСШ ,ми взяли дві групи обстежених за 2009-2011рр—до однієї віднесли вагітних (обстежених на ТОРСН-комплекс)- 470,до іншої чоловіки з діагнозом „Уретрит”-172, всього 642 людини.

Кількість аналізів проведених конкретній групі пацієнтів склало 3350 і 860 відповідно.

Матеріалом для дослідження стали зішкріби епітеліальних клітин із слизових уретри, цервікального каналу і шийки матки вагітних , а також мазки із уретри у чоловіків на широкий спектр інфекційних агентів. 

Нозологічна форма

Процент виявляємості серед:

вагітні жінки

чоловіки з уретритом

U.urealyticum/parvum

51,2%

43,1%

Gardnerella vaginalis

42,2%

12,1%

Mycoplasma hominis

12,8%

11%

Mycoplasma genitalium

4%

4%

Chlamydia trachomatis

12%

9%

HPV 16,18

10%

8%

Cytomegalovirus

8,4%

2%

Herpes Simplex virus type I,II

2,2%

2%

Trichomonas vaginalis

2%

1%

Neisseria gonorrhoeae

0%

0%

Для порівняння:

Соболева В.І ( матеріали конференції 2010рік)

Нозологічна форма

Процент виявляємості серед:

вагітні жінки

чоловіки з уретритом

U.urealyticum/parvum

52,8%

43,1%

Gardnerella vaginalis

41,2%

12,1%

Mycoplasma hominis

13,6%

11%

Mycoplasma genitalium

не проводилось

не проводилось

Chlamydia trachomatis

10%

9,8%

HPV 16,18

12,9%

не проводилося

Cytomegalovirus

7,4%

не проводилося

Herpes Simplex virus type I,II

2,44%

2,1%

Trichomonas vaginalis

4,6%

2,15%

Neisseria gonorrhoeae

0%

0%

 

Отримані дані говорять про те, що серед чоловіків з діагнозом „Уретрит”, так і серед вагітних жінок домінує уреаплазмоз, який може виступати як самостійний діагноз, так і в поєднанні з іншими інфекціями. До того ж, у вагітних жінок відмічається висока стійкість U.urealyticum/parvum до антибіотикотерапії і неспецифічному лікуванні імунопрепаратами і пробіотиками. Цей мікроорганізм продовжує виявлятися в зшкрібках жінок і при подальшому повторному дослідженні на великих термінах вагітності (73%). В той же час, U.urealyticum/parvum, яка виявляється у чоловіків, дуже добре і швидко піддається лікуванню.

      Відмічається також висока зустріч асоціації U.urealyticum/parvum і Mycoplasma hominis (21,1%), частота цієї асоціації у жінок 4,5 разів вища, ніж у групі чоловіків .(С частота цієї асоціації у жінок 4,5 разів вища, ніж у групі чоловіків (Соболева В.І. 2010р).

      Друге місце у групі вагітних жінок міцно тримає Gardnerella vaginalis, яка дуже часто зустрічається з U.urealyticum/parvum (45%), і також важко піддається лікуванню.

       Отримані дані говорять про те , що імунна система вагітної жінки знаходиться в пригніченому стані і не може впоратися з персистуючою інфекцією. У чоловіків з уретритом Gardnerella vaginalis також стоїть на другому місці, але в поєднанні зустрічається дуже набагато рідше (15%).

      Метод ПЛР є найефективніший при виявленні Chlamydia trachomatis( протікає частіше як моно інфекція) і HPV 16,18. Отримані в ході роботи дані практично повністю співпадають з клінічними, виявленими урологами і гінекологами захворюваннями, які викликаються даними мікроорганізмами. Невеликий процент розбіжностей (3% Соболева В.І.), напевно із-за латентного протікання інфекції.

      Отримані дані з гонореї та трихомонозі  за період нашої роботи, скоріше всього, говорять про відтік пацієнтів в приватні лабораторії і клініки або в спеціалізовані медичні установи з контролю за ІПСШ, чим зниження кількості зустрічей цих нозологій.

Висновок :

 

На мій погляд , в результаті проведеного аналізу одержано цікаві результати.

Безумовно, їх трактування неоднозначне і потребує обговорення в більшому форматі.

Надіюсь ,що і в представленому вигляді результати моїх спостережень мають певний інтерес.ї

Планую продовжити дослідження,а також моніторинг виявлення інфекцій протягом 3- 5 років.

 

Маю надію, що робота нашої лабораторії буде цікава лікарям міста Чернігова та Чернігівської області, запрошуємо до співпраці.



powered by Legacy - 2013